肿瘤研究中有很多热点问题，其中肿瘤的耐药性备受研究者的青睐，关于肿瘤耐药的研究逐年增高。今天，我们将介绍这篇年4月发表在NatureCommunications上的文章，这篇文章整体方法学并不复杂，机制也易复现，之所以可以发表在NC上，是因为从本文从临床问题出发，并聚焦于肿瘤研究的热点问题，逻辑清晰的说明并解决了所提出的临床问题。这篇文章很适合作为肿瘤耐药研究的示范文章，因此我们将基于这篇NC详细阐述肿瘤耐药研究的科研套路，助你把握研究热点，发表高分文章。
一、研究背景耐药性是大多数人类肿瘤治疗的主要障碍。目前应用于实体瘤的主要化疗用药为铂类、氟尿嘧啶、表柔比星等引起DNA损伤进而导致细胞凋亡的药物。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径，是控制细胞凋亡的重要途径，并已证明其中的p38途径及JNK途径参与铂类及诱导细胞凋亡的调控。MAPK途径主要是受双重特异性磷酸酶（DUSPs）蛋白调控的，已知DUSP16同时抑制p38和JNK的蛋白。然而，尚不清楚DUSP16是否调节癌症对铂类疗法和其他药物的敏感性。因此，这篇文章从多维度研究了DUSP16对化疗药物耐药性的影响。
二、研究思路1.1表型研究-细胞系的相关性：DUSP16表达水平与顺铂耐药性呈正相关
研究方法与结果：
A、B:qRT-PCR和WB法检测鼻咽癌细胞系中DUSP16的mRNA及蛋白水平，以区分DUSP16高表达与低表达的细胞系；
C：qRT-PCR和WB法检测顺铂不同时间处理的的鼻咽癌细胞系中DUSP1的mRNA及蛋白水平，以证明顺铂处理时间越长，DUSP16的表达水平越高；
D：流式细胞术凋亡检测法比较DUSP16高表达与低表达细胞系对顺铂的敏感性的区别，以证明DUSP16高表达的鼻咽癌细胞系对顺铂耐药性更高；
图1.DUSP16蛋白表达水平与癌细胞对顺铂的敏感性相关
套路1：通过对肿瘤细胞系中目标基因的蛋白水平与药物敏感性做相关性分析，以论证这个基因与某一药物耐药有关。
1.2表型研究-过表达导致耐药：在低表达DUSP16且对顺铂敏感的细胞系中过表达DUSP16可引起耐药
A-C（鼻咽癌细胞系）：WB及qRT-PCR法检测过表达效率（A），凋亡染色比较过表达DUSP16对顺铂的敏感性的影响，以证明在鼻咽癌细胞系中过表达DUSP16可促进对顺铂的耐药；
图2.DUSP16在各种类型的癌细胞中过表达
导致对顺铂的耐药性增加
套路2：在敏感且低表达特定基因的细胞株中过表达这一基因，观察是否诱发耐药。1.3表型研究-扩大药物种类验证：验证DUSP16是否影响肿瘤对卡铂和奥沙利铂的敏感性
A：通过流式细胞术凋亡染色比较DUSP16高低表达的细胞对卡铂和奥沙利铂的敏感性差异；
B：挑选鼻咽癌中低表达DUSP16且对卡铂和奥沙利铂敏感的细胞，过表达DUSP16，并通过流式细胞术凋亡染色比较DUSP16过表达前后肿瘤细胞对卡铂和奥沙利铂的敏感性差异。
图3.不同类型癌细胞中DUSP16的水平
与对卡铂和奥沙利铂的敏感性相关
套路3：应用套路1与套路2，扩大药物范围，提高广度与意义。上述实验证明：DUSP16可以促进鼻咽癌，大肠癌和胃癌对铂类药物的耐药性。
2.1机制验证-寻找影响到了什么？：DUSP16过表达抑制了顺铂诱导的P38及JNK的活化（呼应Figure1G-H）
A（鼻咽癌细胞）,B（大肠细胞）,C（胃癌细胞）：通过WB法检测顺铂处理不同时间，DUSP16过表达前后MAPK下游途径的活化情况，发现顺铂诱导后，肿瘤细胞出现了P38与JNK途径的活化，且DUSP16过表达抑制了这种活化；
2.2机制验证-联系线粒体介导的细胞死亡
D-E:通过WB法检测了顺铂处理不同时间，DUSP16过表达前后，细胞色素C的蛋白水平变化（D）以及流式细胞术检测线粒体膜电位（JC-10染色）变化，发现顺铂处理后发生了线粒体介导的细胞死亡，而过表达DUSP16后逆转了这一现象，以证明DUSP16提高了线粒体的功能，抑制了顺铂诱导的细胞死亡；
F：WB方法检测顺铂处理不同时间，DUSP16过表达前后，线粒体内促凋亡蛋白BAX的蛋白水平，实验发现顺铂处理导致了线粒体中促凋亡蛋白BAX的积累增加，但过表达DUSP16后逆转了这一现象；
G-H（依赖性验证-很重要）：检测在BAX野生及敲除的大肠癌细胞中过表达DUSP16前后是否对顺铂的敏感性有影响，实验发现，在野生型BAX的细胞株中，过表达DUSP16可促进大肠癌细胞对顺铂的耐药性，但是在敲除BAX的细胞株中，过表达DUSP16并不能促进其耐药，这证明了DUSP16对线粒体功能及顺铂耐药性的影响是依赖于BAX的。
综上，机制实验证明了DUSP16通过BAX调节线粒体介导的细胞死亡进而促进肿瘤对顺铂的耐药性。
图4.DUSP16过表达抑制了BAX介导的
各种类型癌细胞对顺铂的内在凋亡途径
套路4：寻找耐药机制，并在敲除下游蛋白X的情况下过表达目标基因观察是否还能诱导耐药，证明目标基因的功能是依赖于下游蛋白X的。3.过表达的体内验证
A：在上述细胞中过表达DUSP16，并进行裸鼠成瘤，检测过表达DUSP16组与对照组对顺铂耐药性的差异；
C,D：免疫组化检测各组组织样本的caspase3水平，检测体内DUSP16对顺铂诱发的凋亡的影响
图5.DUSP16的过表达导致癌细胞对
体内顺铂治疗的抵抗力增加
套路5：动物实验内同时验证功能（肿瘤体积，重量等）与机制（IHC染色）。4.1敲除验证-体外验证：
A-C：在鼻咽癌高表达DUSP16且对顺铂耐药的C-1细胞中敲减DUSP16，并通过流式细胞术凋亡染色检测敲减DUSP16前后C-1细胞对顺铂耐药性的改变，进行反向验证；
D-E:WB法检测顺铂处理不同时间段，DUSP16敲减前后下游MAPK途径中关键标志物蛋白水平的变化，并发现敲减DUSP16后增强了顺铂诱导的P38和JNK的活化（呼应Figure4）。
图6.DUSP16敲低增强了C-1细胞
对顺铂的细胞凋亡
套路6：挑选高表达目标基因且相对耐药的细胞系进行目的基因的敲减，进行反向验证。4.2临床样本水平验证（很重要）
E,F：通过对接受铂类药物治疗的乳腺癌患者的手术切除组织进行免疫组化染色，并区分高低表达DUSP16的患者，分析高表达DUSP16的患者与低表达DUSP16的生存差异，在临床水平上验证了高表达DUSP16的乳腺癌的患者对铂类药物有更高的耐药性；
图7.C-1细胞中的DUSP16敲低
导致体内对顺铂的敏感性增加，
DUSP16水平与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)
患者和乳腺癌患者的存活率呈负相关
套路7：临床样本验证，对接受这种药物治疗的患者进行IHC染色，并对高低表达目标基因的患者进行生存分析，以临床问题收尾（很重要）。建议在此处加入TCGA/GEO数据库中的生存分析验证，会更有说服力！三、全文总结整体梳理一遍全文，可以发现本文的逻辑性很强，作者首先在细胞水平证明了DUSP16的表达与顺铂的耐药性相关，接着又通过过表达DUSP16在细胞水平验证了DUSP16对顺铂耐药性的影响，并进一步扩大了铂类药物的范围，证明DUSP16对卡铂和奥沙利铂耐药也有促进作用；进一步，作者寻找了DUSP16逆转顺铂诱导凋亡的内在机制，并在动物水平验证了DUSP16对顺铂耐药性和顺铂诱导的内在凋亡的影响；接着，作者通过敲减DUSP16验证了上述功能及机制，并在动物水平及临床样本水平进一步证明。
最后，高水平的科研论文需要强大的逻辑支持与多维度的论据支持，掌握好这些，发表高水平论文其实并不难！
—END—注：此推文未经许可禁止转载！阅读推荐：心脏最火的线粒体研究来啦！Circulation全面解读
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